R&D : microscopie de fluorescence quantitative

Microscopie de Fluorescence Quantitative

Directement adossée à la plate-forme MRic-Photonics et en collaboration étroite avec les biologistes de la communauté Rennaise, l'équipe «Microscopie de Fluorescence Quantitative» a pour vocation de développer des techniques et des méthodologies en microscopie de fluorescence pour étudier la dynamique des interactions protéiques et des activités biochimiques sur échantillon vivant.

 

Développement technologique : le prototype fastFLIM pour l'imagerie de FRET

L'objectif est d'obtenir une acquisition très rapide de FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) pour le suivi spatio-temporel du FRET (Forster Resonance Energy Transfer) quantitatif dans des échantillons vivants. Ce prototype est développé sur un microscope spinning disk en adaptant un laser visible pulsé picoseconde à forte puissance à l'excitation et une camera CCD intensifiée à porte temporelle à l'émission. Sur le même système, un mode en polarisation sera adapté pour l'imagerie d'anisotropie de fluorescence.

 
Cinq images avec une porte temporelle de 2ns acquisent séquentiellement sont suffisantes pour calculer une image de FLIM permettant une vitesse d'acquisition rapide (à gauche).
Un exemple de FRET quantitative par fastFLIM pour l'interaction Amphiphysin et N-Wasp localize à la périphérie de la membrane est présenté (à droite, adapté de Yamade et al., JBC, 2009)

 

Développement méthodologique : les bio-senseurs d'activité Kinase

Les activités kinases sont mesurées par des bio-senseurs FRET en se basant sur les propriétés de changement conformationnel de la kinase suivant son activation après phosphorylation. Les méthodologies associées (i) en utilisant différents couples de protéines, (ii) en utilisant le FLIM pour la quantification et (iii) en introduisant des bio-senseurs homoFRET, sont particulièrement intéressantes pour augmenter la sensibilité, la vitesse d'acquisition et donc la relevance de ce type d'approche en biologie.

 

Méthodes d'imagerie de correlation de fluorescence pour les interactions protéiques

(i): FLCS deux couleurs

Corrélation croisée GFP-mCherry par FLCS. FCCS classique et par la méthode de FLCS pour des cellules exprimant GFP et mCherry séparément (courbes du haut) et en tandem (courbes du bas).On peut observer que l'artefact de passage de la fluorescence de la GFP dans le canal rouge sur la corrélation croisée est inexistante pour les courbes obtenues par FLCS.

(ii): Méthodes de correlation d'images

En collaboration avec l'équipe de Maité Coppey à l'IJM, le projet consiste à utiliser les méthodes de corrélation d'images (ICS, STICS, RICS, N&B) pour caractériser la diffusion de macromolécules ou de complexes macromoléculaires sur échantillon vivant.